超敏ECL發(fā)光液使用說(shuō)明書(shū)

（初次使用本產(chǎn)品請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書(shū)）

    在western實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)靈敏度是很重要的參數(shù)，而發(fā)光底物的發(fā)光效率很大程度的決定了western檢測(cè)靈敏度，培清科技開(kāi)發(fā)的此超敏ECL發(fā)光液，作為HRP的底物，其發(fā)光效率高于Pierce SuperSignal West Dura的發(fā)光液16倍?？蓹z測(cè)最低值15飛克抗原。并且其本底發(fā)光遠(yuǎn)低于Pierce SuperSignal West Dura和Millipore immobilon ECL，本發(fā)光液支持長(zhǎng)時(shí)間曝光。另外，本產(chǎn)品穩(wěn)定性高支持室溫存放。包裝規(guī)格：A液 25ml B液 25ml 4℃或室溫保存，室溫一年，4℃兩年有效。

使用說(shuō)明：
1. 超敏ECL發(fā)光液工作液的配制：等體積混合適量A液和B液，室溫放置備用。工作液宜在臨檢測(cè)前配制。
2. Western二抗孵育后，并進(jìn)行數(shù)次洗滌后，用平頭鑷將膜取出，然后置于一潔凈保鮮膜或本公司配贈(zèng)的曝光夾膜上。
3. 根據(jù)膜的大小，按每10平方厘米膜加0.5ml 工作液，滴加工作液到膜上，確保使工作液均勻覆蓋在膜上。
4. 取膜，棄工作液，將膜放在兩片保鮮膜中間或本公司配贈(zèng)的曝光夾膜內(nèi)，隨后進(jìn)行壓片檢測(cè)或化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。
5. 壓片檢測(cè)：將膜固定于片夾內(nèi)。暗室內(nèi)壓片10秒-10分鐘，立即顯影定影，根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時(shí)間?；蛑苯尤?張X光片疊加在一起進(jìn)行曝光，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。
6. 熒光成像儀檢測(cè)：將膜放置到化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)，參考儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

1， A液和B液在吸取過(guò)程中必須要更換槍頭，A液和B液相互污染后會(huì)導(dǎo)致A液或B液逐漸失效，影響后續(xù)的使用效果。 
2， 部分塑料材料或染料具有熒光淬滅的副作用，保鮮膜為食品級(jí)PP材料，不產(chǎn)生熒光淬滅的效應(yīng)，但保鮮膜太柔軟易褶皺，操作麻煩，并易造成背景因褶皺產(chǎn)生的不均勻，推薦客戶使用曝光夾膜進(jìn)行western曝光操作，此膜雙層硬質(zhì)高透光（透光率高于97%），熒光不淬滅，不會(huì)褶皺，信號(hào)更均勻，操作簡(jiǎn)單。
3， 由于本發(fā)光液靈敏度高，一抗和二抗?jié)舛却髸r(shí)易造成高背景，推薦使用培清科技低背景封閉及抗體增敏稀釋液，可有效降低背景。二抗?jié)舛戎苯記Q定背景深度，羊抗兔羊抗鼠HRP二抗，若使用培清科技的產(chǎn)品，統(tǒng)一1:10000和1:5000，其他品牌二抗須由客戶測(cè)試后確定。若客戶需要將膜上抗體剝離掉進(jìn)行其他抗原檢測(cè)，此時(shí)務(wù)必使用培清科技開(kāi)發(fā)的膜上抗體高效剝離液，其他品牌的剝離液經(jīng)培清科技內(nèi)部檢測(cè)，基本都不可以去除膜上殘余信號(hào)，并且大多傷害膜上抗原。

附：一，不同品牌發(fā)光液發(fā)光時(shí)間及靈敏性測(cè)試：

將本公司羊抗兔二抗（0.5mg/ml)用PBS稀釋20000倍后，4倍倍比稀釋9次，各取1.5ul點(diǎn)于NC膜上（PALL,0.22um)，室溫放置10min后，加入不同品牌發(fā)光底物，其中1為培清科技本產(chǎn)品，2為millipore immobilon ECL,3為pierce SuperSignal West Dura, 4為pierce ECL底物。通過(guò)即刻曝光10秒和50秒來(lái)比較不同發(fā)光液靈敏性，之后將此含有發(fā)光底物的膜靜置50分鐘后再次檢測(cè)，以比較不同發(fā)光液的發(fā)光持續(xù)時(shí)間，檢測(cè)設(shè)備為制冷CCD化學(xué)發(fā)光成像儀（2x2像素合并）。
結(jié)果表明，培清科技超敏發(fā)光液檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于其他國(guó)際著名品牌（其中高于pierce ECL 16倍），并且支持長(zhǎng)時(shí)間曝光，而millipore immobilon ECL和pierce ECL會(huì)隨時(shí)間快速衰減，pierce SuperSignal West Dura也可比較持久發(fā)光，但靈敏度低于培清科技本產(chǎn)品4倍。
歡迎廣大客戶一起重復(fù)此簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)，不僅可掌控本實(shí)驗(yàn)室發(fā)光液質(zhì)量，也可質(zhì)控二抗質(zhì)量。

二，不同發(fā)光液本底發(fā)光情況測(cè)試

剪去4小片NC膜（pall 0.22um),在其上直接滴加上述實(shí)驗(yàn)所用的四種發(fā)光液，發(fā)光液對(duì)應(yīng)編號(hào)1,2,3,4也與上述實(shí)驗(yàn)一致，先利用外部反射光源對(duì)4片NC膜進(jìn)行拍照，記錄位置，再關(guān)掉外部光源利用制冷CCD拍照5分鐘，獲得以下結(jié)果。
結(jié)果表明，培清科技超敏發(fā)光液（對(duì)應(yīng)1號(hào)）發(fā)光本底遠(yuǎn)低于其他著名品牌（對(duì)應(yīng)2,3,4號(hào)），可以推論，之前客戶使用進(jìn)口的靈敏度比較高的發(fā)光液，很容易產(chǎn)生整張膜高背景，如果排除封閉液質(zhì)量不高，洗膜不徹底這兩大因素，發(fā)光液本底高背景為一個(gè)原因?？蛻艚鉀Q高背景的手段是稀釋一二抗，但這是以犧牲檢測(cè)靈敏度為代價(jià)的。

 三，封閉液，漂洗液，發(fā)光液影響western背景的多因素測(cè)試

我們?cè)O(shè)計(jì)了客戶可方便重復(fù)的簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)，選取4

小片NC膜（pall 0.22um),分別用5%光明牌脫脂奶粉TBST溶液封閉（下圖左側(cè)兩膜）和自主開(kāi)發(fā)的western低背景封閉及增敏稀釋液進(jìn)行封閉（下圖右側(cè)兩膜），室溫封閉30分鐘后，直接加入HRP標(biāo)記二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h,之后分別用傳統(tǒng)的TBST緩沖液洗膜（下圖上方兩膜）和改進(jìn)的TBST洗膜液洗膜（下圖下側(cè)兩膜），漂洗兩次，每次10分鐘。之后加入millipore immobilon ECL進(jìn)行曝光，曝光時(shí)間4.5min，曝光后4張膜用PBS快速漂洗兩次，加入本超敏發(fā)光液，進(jìn)行曝光，曝光30sec，從而獲得以下結(jié)果。另外本實(shí)驗(yàn)中的傳統(tǒng)TBST，5%奶粉溶液為新配置試劑，低背景封閉液（貨號(hào)F00)及改進(jìn)后的TBST緩沖液(貨號(hào)F05)按說(shuō)明書(shū)提示為室溫長(zhǎng)效保存試劑，故選取室溫放置7個(gè)月并在非無(wú)菌環(huán)境下反復(fù)打開(kāi)操作過(guò)的試劑。

結(jié)果表明，奶粉溶液封閉30min，配合使用兩種靈敏度較高的發(fā)光液，將產(chǎn)生很強(qiáng)的背景信號(hào)，而低背景封閉液則可通過(guò)較短時(shí)間封閉高效降低背景，改進(jìn)后的TBST緩沖液可在一定程度進(jìn)一步降低背景。超敏發(fā)光液可在更短的時(shí)間內(nèi)獲得其他發(fā)光液長(zhǎng)時(shí)間曝光才能獲得的信號(hào)強(qiáng)度。

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