Ni-TED Agarose Resin 6FF以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法偶聯(lián)三（羧甲基）乙二胺（TED）為配體，螯合鎳離子（Ni²⁺）而制備成的一種介質(zhì)。Ni-TED Agarose Resin 6FF與Ni²⁺具有5個螯合位點，使得其對于 Ni²⁺具有很強的約束力，這一特性賦予了本品具有優(yōu)異的 DTT 以及 EDTA 耐受性。本品用于帶有 His 標簽的蛋白純化時擁有穩(wěn)定性高、復(fù)雜環(huán)境中一步純化蛋白、目標蛋白質(zhì)吸附量大（但會低于Ni-NTA）、蛋白洗脫條件溫和、介質(zhì)易再生、重復(fù)利用率高等優(yōu)點。

產(chǎn)品性質(zhì)

運輸和保存方法

冰袋運輸。2-8℃保存。有效期4年。

注意事項

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用方法

• 純化流程

1 緩沖液的準備

緩沖液使用原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾除菌。

平衡緩沖液：20 mM PB，0.5 M NaCl，pH 7.4

洗雜緩沖液：20 mM PB，0.5 M NaCl，0-30 mM 咪唑，pH 7.4

洗脫緩沖液：20 mM PB，0.5 M NaCl，50-500 mM 咪唑，pH 7.4

2 樣品準備

在上樣前將宿主細胞碎片通過離心等方式去除，7000 rpm離心15 min，收集上清。然后過 0.45um 的微孔濾膜。為了獲得最大的載量，不要在樣品蛋白溶液中添加咪唑。

3 裝柱

1）用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm的去離子水。

2）將樹脂懸浮，小心地將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3）如果使用儲液器，應(yīng)立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進樣管中產(chǎn)生氣泡。

4）打開層析柱底部出口，開啟泵，使其在設(shè)定的流速下進行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如達不到推薦的壓力或流速，可以用所用泵的最大流速，這樣也可以達到一個較好的裝填效果。當柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱體積的去離子水。標上柱床高度?！咀ⅰ吭陔S后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%。

5）關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6）如使用儲液器，去除儲液器，將分配器置于層析柱中。

7）將分配器推向柱子至標記的柱床高度處。允許裝柱液進入分配器，鎖緊分配器接頭。

8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如需要可重新調(diào)整分配器。

4 樣品純化

裝柱后，可用各種常規(guī)的中壓色譜系統(tǒng)，以AKTA使用為例進行說明：

1）將泵管道注滿去離子水。去掉產(chǎn)品上塞，連接至色譜系統(tǒng)中，打開下出口，將純化柱連接到色譜系統(tǒng)中，注意旋緊。

2）3-5倍柱體積去離子水沖洗純化柱。

3）至少5倍柱體積的平衡緩沖液平衡色譜柱。1 mL規(guī)格預(yù)裝柱推薦流速為1 mL/min，5 mL預(yù)裝柱推薦流速為5 mL/min。

4）利用泵或注射器上樣，收集流出液，以便SDS-PAGE檢測蛋白結(jié)合情況?！咀ⅰ咳魳悠氛扯仍黾?，即使上樣體積很少也會導(dǎo)致層析柱很大反壓；上樣量不要超過柱子的結(jié)合能力；大量樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進樣器更難使用。

5）洗雜緩沖液沖洗柱子，直到紫外吸收達到一個穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個柱體積）。

  【注】在樣品和結(jié)合緩沖液中加入低濃度咪唑可以提高樣品純度。

6）洗脫緩沖液一步法或梯度法進行洗脫。一步法洗脫中一般5倍柱體積洗脫液即可。梯度洗脫可以用一個小的梯度，例如20倍柱體積或更多來分離不同結(jié)合強度的蛋白質(zhì)。

7）隨后依次用2倍柱體積的1 mol/L NaOH和5倍柱體積的去離子水清洗填料。5倍柱體積的20%乙醇平衡樹脂，最后將填料保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4 ℃保存。

5 SDS-PAGE檢測

將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進行檢測，判定其純化效果。

二、在位清洗

當填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時，需對其進行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除強疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類

使用30%異丙醇清洗5-10個柱體積，接觸時間為15-20 min可以去除此類污染物。之后再用去離子水清洗10倍柱體積。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或者堿性溶液清洗填料2倍柱體積。例如含有0.1-0.5%非離子去污劑的0.1 M醋酸溶液，接觸時間為1-2 h。去污劑處理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱體積，徹底去除去污劑。最后利用去離子水清洗10倍柱體積。

2 去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接觸10-15 min，之后用去離子水清洗10倍柱體積。

HB221104